Sau khi học, học viên có khả năng:
Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN
Trình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành định lượng E.coli giả định trong môi trường nước bằng phương pháp MPN.
Bạn đang xem trước 20 trang nội dung tài liệu Định lượng E.coli giả định bằng phương pháp mpn, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ĐỊNH LƯỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNHBẰNG PHƯƠNG PHÁP MPNPhạm Thị Vinh HoaPhòng Xét nghiệm trung tâm- Indicators of microbial water quality: General [process] microbial indicatorsFaecal indicators [such as E. coli]Index organisms and model organisms.US Environmental Protection Agency The EPA has determined that E. coli are one of the best indicators for the presence of potentially pathogenic bacteria. Because E. coli monitoring does not measure the actual pathogens, the assessment is not foolproof, however, it is a good approach for assessing the likelihood of risks to human health. Monitoring for these indicator organisms is an easy and economical method for citizens or professionals to assess health risks due to bacterial contamination of surface waters. coli [E. coli]: Thermophilic coliforms that produce indole from tryptophan, but also defined now as coliforms able to produce β-glucuronidase [although taxonomically up to 10% of environmental E. coli may not]. Most appropriate group of coliforms to indicate faecal pollution from warm-blooded animals.ẠI SAO CẦN KIỂM TRA ESCHERICHIA COLI?ESCHERICHIA COLIình que, Gram-âm, không sinh bào tử Lên men đường lactose sinh hơi và acid ở 44oCSự có mặt của E.coli khẳng định sự nhiễm khuẩn từ phânTÀI LIỆU THAM KHẢOTCVN 5999:1995 [ISO 5667/10:1992]: Chất lượng nước. Lấy mẫu. Hướng dẫn lấy mẫu nước thảiTCVN 8880:2011 [ISO 19458:2006]: Chất lượng nước. Lấy mẫu để phân tích vi sinh vậtTCVN 6187-2:1996 [ISO 9308/2:1990]: Chất lượng nước. Phát hiện và đếm vi khuẩn coliform, vi khuẩn coliform chịu nhiệt và escherichia coli giả định. Phần 2: Phương pháp nhiều ống [số có xác suất cao nhất]MỤC TIÊU HỌC TẬPSau khi học, học viên có khả năng:Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPNTrình bày được phạm vi áp dụng, nguyên tắc và các bước tiến hành định lượng E.coli giả định trong môi trường nước bằng phương pháp MPN.Nhận định được kết quảNỘI DUNG BÀI GIẢNG1. Phạm vi áp dụng & nguyên lý2. Phương pháp MPN3. Chuẩn bị thí nghiệm4. Các bước tiến hành5. Đọc kết quảPhạm vi áp dụng Đếm số lượng coliform, coliform chịu nhiệt, và E.coli giả định trong mọi loại nước, kể cả nước có vật chất lơ lửng.Nguyên lýE.coli: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol từ tryptophan khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh chọn lọc ở 44oC bằng phương pháp tính số có xác suất lớn nhất [Most Probable number -MPN]PHẠM VI ÁP DỤNG & NGUYÊN LÝPHƯƠNG PHÁP MPNnồng độ 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 độ pha loãng 101 102 103 104 105 106 107 Nồng độ và độ pha loãng mẫuPHƯƠNG PHÁP MPNXác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫuMỗi độ pha loãng được lặp lại nhiều lần [3 lần]Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và âm tínhSố lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫuNguyên tắc:Hai hệ thống MPN: Hệ thống 9 ống Hệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPNĐặc điểm:VSV mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy: sinh hơi, đổi màu môi trường... Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớnPHƯƠNG PHÁP MPNHệ thống 9 ốngHệ thống 15 ống10 ml môi trườngPHƯƠNG PHÁP MPN1. Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN2. Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN3. Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợpCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN4. Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của VSV cần kiểm địnhSự đổi màu của môi trườngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN5. Ghi nhận số ống dương tính ở từng độ pha loãngCác bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả101102103Các bước tiến hànhPHƯƠNG PHÁP MPNThứ tự ưu tiên chọn từ 1 41. Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống [+] chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính. Ví dụ 1 nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này không có ống [+] chọn nồng độ lớn nhất không có ống [+] và 2 nồng độ lớn hơn để tính. Ví dụ 4, 52. Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có tất cả các ống [+] chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ nhất trong cả dãy. Ví dụ 23. Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong đó có ít nhất 1 ống [+]. Ví dụ 34. Chỉ nồng độ đầu tiền có ống [+] chọn thêm 2 nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng độ này không có ống [+] nào. Ví dụ 6, 7MẫuSố ống [+]13 3 2 1 023 3 3 3 032 2 1 1 043 3 0 0 052 2 0 1 0 63 0 0 0 072 0 0 0 0____ tổ hợp được chọnLựa chọn các độ pha loãng để tính kết quảKết quả: Số VSV [MPN/ml] = kết quả tra bảng x [f/10] Trong đó: f: độ pha loãng thấp nhất được chọn [10n]Biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10n [n là số mũ thích hợp của 10]Ví dụ: PHƯƠNG PHÁP MPN103104105201Kết quả:14x103/10=1,4x103 [MPN/ml]Tra bảngPHƯƠNG PHÁP MPN6. Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSVTra bảngMPN/100mlKết quả70x101/10=7,0x101 [MPN/ml]101102103PHƯƠNG PHÁP MPNSố VSV = 7,0x101 MPN/mlHệ thống 15 ốngPHƯƠNG PHÁP MPN321Kết quả?102103104Hệ thống 9 ốngPeptone water FlaskPipette Dụng cụ, Môi trường phải được khử trùng Môi trường phải được kiểm chứngLTS brothCHUẨN BỊ THÍ NGHIỆMEC brothThuốc thử Indol [Kovacs]Chủng chuẩn+ Chứng âm: Salmonella typhimurium ATCC 14028+ Chứng dương: Escherichia coli ATCC 25922Bước 1: Chuẩn bị mẫu Lấy 100ml mẫu nước bề mặt vào bình tam giác nồng độ 10o CÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 2: Pha loãng mẫu Hút 1ml mẫu + 9ml MT peptone trong ống nghiệm nồng độ 10-1. Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-2 và 10-3 Bước 3: Nuôi cấy trên môi trường tăng sinh/chọn lọc 1 Nồng độ đơn: Hút 1ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. Nồng độ kép: Hút 10ml mẫu pha loãng + 10ml MT Tryptose Lauryl Sunfat trong ống nghiệm nuôi cấy ở 37±1oC/24-48h. kết quả [+]: sử dụng lactose sinh khíBước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 Cấy chuyển từ MT LTS [+] sang MT EC broth nuôi cấy ở 44oC/48hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHBước 5: Thử sinh hóa khẳng định cho E.coli Cấy chuyển từ MT EC broth [+] sang MT trypton nuôi cấy ở 44oC/48h nhỏ 0.5ml dd Kovacs vào ống nuôi cấy kết quả [+]: sử dụng lactose sinh khí kết quả [+]: tạo vòng Indol màu đỏThử nghiệm khả năng sinh IndolMục đíchPhát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym tryptophanaseChủng VSVMT canh tryptonThuốc thử Kovac’sPứ dương tínhPứ âm tính44oC / 24hCÁC BƯỚC TIẾN HÀNHSơ đồ các bước định lượng E.coli giả địnhĐỌC KẾT QUẢ[+][-][-][+]Coliforms/E.coli trong MT LTS ĐỌC KẾT QUẢE.coli trong MT ECE.coli sinh Indol[+][-]Nhiệm vụ của nhóm1. Nhóm 1 đến 5: mẫu MT PD05 Nhóm 1: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 2: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 3: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 4: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 5: 10-5, 10-6, 10-72. Nhóm 6 đến 10: mẫu MT HSPH Nhóm 6: 10-1, 10-2, 10-3 Nhóm 7: 10-2, 10-3, 10-4 Nhóm 8: 10-3, 10-4, 10-5 Nhóm 9: 10-4, 10-5, 10-6 Nhóm 10: 10-5, 10-6, 10-73. Nhóm 11: mẫu chứng âm, dương Chứng âm: Salmonella Chứng dương: E.coli
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- dinh_luong_e_coli_gia_dinh_track_skmtnn_1789.ppt
MPN là gì, CFU là gì? Hai thuật ngữ này có gì khác nhau. Hãy cùng các chuyên gia của Nihophawa theo dõi và tìm hiểu qua bài viết này.
MPN là gì?
MPN viết tắt của Most probable number. Đây là phương pháp sử dụng ước tính nồng độ các vi sinh vật khả thi trong 1 mẫu bằng cách tái tạo sự tăng trưởng của vi sinh trong nước pha loãng gấp 10 lần. Phương pháp này thường sử dụng để ước tính quần thể vi sinh vật trong đất, nước, nông sản và đặc biệt hữu ích với các mẫu có chứa vật liệu hạt.
Mục đích áp dụng MPN
MPN được áp dụng phổ biến trong kiểm tra chất lượng nước. Tức là đảm bảo an toàn về mặt số lượng vi khuẩn trong đó. Một nhóm vi khuẩn được gọi là coliform đóng vai trò báo hiệu chỉ số ô nhiễm phân của nước. Sự hiện diện ít vi khuẩn coliform phân thể hiện nước không chứa sinh vật gây bệnh. Trong khi sự hiện diện của lượng vi khuẩn coliform lớn sẽ thể hiện khả năng rất cao là nước chứa sinh vật gây bệnh. Làm cho nước không an toàn để sử dụng.
MPN được coi là yếu tố quan trong trong việc kiểm định chất lượng vi khuẩn trong nước thải có đảm bảo an toàn khi thải ra môi trường. Đây cũng là một chỉ số giúp đánh giá hiệu quả của hệ thống xử lý nước thải y tế phòng khám của Nihophawa hiện nay.
Nguyên tắc thử nghiệm MPN
Mẫu nước được pha loãng và tiêm vào nước dùng đường sữa. Khuẩn coliform có trong nước sẽ sử dụng đường sữa trong dung môi để tạo ra axit và khí. Sụ hiện diện của axit được biểu thị bằng sụ đổi màu của môi trường và sự hiện diện của khí. Như bọt khí thu được từ môi trường dung moi. Số lượng coliform tổng được xác định bằng cách đêm số lượng ống khí cho phản ứng dương tính [nghĩa là thay đổi cả màu sắc và có sản xuất khí]. So sánh mô hình kết quả dương tính với bảng tiêu chuẩn.
Thực hiện kiểm tra MPN
Các bước kiểm tra MPN bao gồm:
Các thử nghiệm giả định bao gồm 1 xét nghiệm sàng lọc lấy mẫu. Nếu xét nghiệm là âm tính, không cần thực hiện thêm thử nghiệm nào nữa. Có thể kết luận nước đảm bảo về mặt vi sinh.
Tuy nhiên, nếu nước xuất hiện axit và khí, nước được coi là không an toàn. Thử nghiệm được xác nhận trên ống thể hiện phản ứng dương tính.
Một số loại vi sinh vật khác ngoài coliform cũng tạo axit và khí trong quá trình lên men đường latose. Để xác nhận sự hiện diện của coliform, cần tiến hành thử nghiệm xác nhận. Mỗi ống lên men có kết quả dương tính cần chuyển sang:
+ 3 ml nước dùng đường latose hoặc ống đã lên men đường latose màu xanh sáng.
+ 1 môi trường thạch
+ 3 ml nước tryptone.
Sau đó thử nước.
Vì 1 số kết quả xét nghiệm dương tính có thể sai. Vì vậy mỗi chủng từ mỗi ống nghiệm dương tính cần được xác nhận.
Sau khi ủ, tất cả các đãi được kiểm tra sự hiện diện của khuẩn lạc điển hình do coliform tạo ra. Sự hiện diện của khuẩn lạc ở nhiệt độ cao cho thấy sự có mặt của Ecoli nhiẹt.
Khái niệm CFU là gì?
Đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU là đơn vị được sử dụng trong vi sinh để ước tính số lượng vi khuẩn hoặc tế bào nấm khả thi trong 1 mẫu nhất định. Khả thi được định nghĩa là khả năng nhân lên thông qua quá trình phân hạch nhị phân ở điều kiện kiểm soát.
Tính toán CFU đòi hỏi phải nuôi cấy các vi khuẩn, chỉ đếm các tế bào khả thi. Ngược lại, đếm bằng kính hiển vi là đếm toàn bộ cả tế bào sống và tế bào chết. Sự xuất hiện trực quan của CFU trong nuôi cấy tế bào đòi hỏi phải có sự tăng trưởng đáng kể. Khi đếm vi khuẩn lạc cần chắc chắn chúng được sinh ra từ 1 hoặc 1 nhóm tế bào. Kết quả biểu thị các đơn vị hình thành khuẩn lạc không phân biệt.
Mục đích của việc tính toán CFU
Mục đích của việc đếm và ước tính số lượng tế bào hiện diện, dựa trên khả năng tạo ra các khuẩn lạc trong 1 diều kiện cụ thể về môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ và thời gian.
Về lý thuyết, tế bào khả thi có thể tạo ra 1 tập khuẩn lạc thông qua sao chép. Tuy nhiên các tế bào đơn ngoại lệ trong tự nhiên khi kết hợp cũng tạo ra 1 quần thể khuẩn lạc. Ngoài ra, nhiều vi khuẩn phát triển thành chuỗi hoặc cục. Vì vậy, ước tính số lượng vi sinh vật bằng CFU có thể vượt qua số lượng tế bào sống có trong 1 mẫu. Lý do là việc đếm CFU giải định mọi quần thể khuẩn lạc đều tác biệt và được thành lập bởi 1 tế bào vi sinh duy nhất.
Thực hiện kiểm tra CFU là gì?
Các đơn vị hình thành khuẩn lạc thường sử dụng để định lượng kết quả đếm vi sinh bao gồm:
- Phương pháp Pour Plate: trong đó mẫu đặt trong đĩa petri sử dụng thạch nóng chảy được làm lạnh đến khoảng 40 – 450C ở ngay trên điểm đông đặc để giảm thiểu tế bào chết do nhiệt. Sau khi miếng thạch đông cứng.
- Phương pháp Spread Plate: trong đó, 1 mẫu với thể tích nhỏ trải đều trên bề mặt đĩa thạch dinh dưỡng. Để khô trước khi ủ.
- Phương pháp Màng lọc: trong đó mẫu được lọc qua bộ màng lọc. Sau đó bộ lọc đặt trên bề mặt của đĩa thạch dinh dưỡng, mặt vi khuẩn hướng lên. Trong quá trình ủ, các chất dinh dưỡng được lọc qua bộ lọc để hỗ trợ các tế bào phát triển. Vì diện tích bề mặt hầu hết các bộ lọc nhỏ hơn so với đĩa Petri tiêu chuẩn. Nên phạm vi tuyến tính số lượng tấm sẽ ít hơn.
- Phương pháp Miles và Misra: Hay còn gọi là phương pháp nhỏ giọt, thường là khoảng 10 micrliter của mẫu pha loãng. Sau đó nhỏ vào đĩa petri. Các đĩa chứa mẫu giọt phải được đọc trong lúc quần thể vẫn còn nhỏ. Tránh tình trạng mất CFU khi chúng cùng phát triển.
Với kỹ thuật sử dụng thạch, không thể sử dụng các dung dịch chất lỏng. Vì độ tinh kiết của mẫu thử không thể xác định và đếm từng tế bào trong chất lỏng.
Sự khác biệt giữa MPN và CFU là gì?
Câu trả lời là 2 phương pháp tương đương nhau. MPN tương đương với CFU. Cả 2 đơn vị đo số lượng vi khuẩn ước tính trong 1 mẫu. Cả 2 đều được công nhận bởi nhiều tổ chức, cơ quan khoa học và quy định trên toàn thế giới. Việc sử dụng MPN hay CFU dựa trên phương pháp phát hiện vi khuẩn. Và cả 2 đều hợp lệ.
Đối với CFU, vi khuẩn phát triển trên môi trường rắn như thạch. Sau đó, đếm khuẩn lạc. Còn đối bới MPN, các mẫu được phát triển trong dung môi lỏng. Các ống nghiệm dương tính được tính toán và so sánh để tạo ra kết quả.
Tóm lại là các phòng thí nghiệm, các quan trên toàn thế giới đều sử dụng MPN và CFU thay thế cho nhau.
Cả 2 phép đo đều được thiết lập để ước tính số lượng vi khuẩn trong 1 mẫu. Độ tin cậy vào khoảng 95%. Các phương pháp màng lọc trong CFR đòi hỏi nhiều bước và mất nhiều thời gian hơn để có kết quả.
Hi vọng với bài viết này của nihophawa.com.vn, các bạn đã hiểu thêm về 2 thuật ngữ liên quan tới vi sinh MPN, CFU là gì?