Nhuộm Gram thực hiện được những điều sau:
Phân loại vi khuẩn theo khả năng bắt màu tím tinh thể [gram dương - xanh] hay không [gram âm- đỏ]
Làm nổi bật hình thái tế bào [ví dụ, que, cầu] và sự sắp xếp tế bào [ví dụ, cụm, chuỗi, xếp đôi]
Xác định bạch cầu đa nhân, cho biết nhiễm khuẩn hơn là nhiễm khuẩn
Những đặc điểm đặc trưng có thể định hướng trực tiếp sử dụng kháng sinh trong khi chờ kết quả khẳng định. Tìm ra nhiều loại vi sinh vật đa hình thái và đặc điểm đặc trưng trên tiêu bản nhuộm. Gram gợi ý bệnh phẩm bị nhiễm bẩn hoặc nhiễm trùng đa vi khuẩn Tìm thấy nhiều tế bào vảy trong mẫu đờm cho thấy mẫu bị nhiễm nước bọt và do đó không thể sử dụng để chẩn đoán.
Để làm một tiêu bản nhuộm Gram, các kỹ thuật viên sẽ cố định bệnh phẩm bằng nhiệt trên một lát cắt và nhuộm bằng cách tiếp xúc tuần tự với tím tinh thể, iodine, chất khử màu, và phản chất nhuộm [thường là safranin].
NGUYÊN TẮC
Các vi khuẩn Helicobacter pylori bắt màu tím đỏ ở khe tuyến, vùng chất nhầy trên bề mặt biểu mô phủ dạ dày.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02.
Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện, hóa chất chung:
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn [70o, 80o, 95o, 100o].
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng [microtome].
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 37o và 56o.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản [đứng và nằm ngang].
Cốc đong loại 1000 ml, 500 ml, 100 ml và 50 ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật:
Phẩm nhuộm: Hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Cố định:
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 - 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2 - 12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm.
Vùi parafin .
Đúc khối parafin.
Cắt và dán mảnh cắt.
Nhuộm mảnh cắt.
Chuẩn bị phẩm nhuộm.
Hoàn tan 0,8 g Giemsa vào 100 ml hỗn dịch glycerol và metanol với khối lượng bằng nhau, lắc đều 2 - 3 ngày trong bình lắc cơ học.
Lọc hỗn dịch trên và coi là dung dịch Giemsa mẹ.
Khi dùng, lấy Giemsa mẹ pha loãng với nước cất, tỷ lệ Giemsa/nước cất là 1/4. Lưu ý là độ pH nên bằng 7,2 và được điều chỉnh bằng đệm photphat.
Các bước tiến hành:
Mảnh cắt được tẩy nến như thường lệ [qua xylen, cồn].
Rửa nước.
Nhuộm tiêu bản trong dung dịch Giemsa đã pha loãng trong 1 giờ.
Rửa nước.
Biệt hóa trong acid acetic loãng [1 giọt acid acetic với 100 ml nước cất].
Rửa nước.
Loại phẩm thừa bằng cồn 95o.
Loại nước bằng xylen.
Gán lá kính bằng bôm Canada.
KẾT QUẢ
Các vi khuẩnHelicobacter pylori [HP] bắt màu tím đỏ.
NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
Các mảnh cắt quá dầy, không có phần niêm mạc sẽ không phát hiện được HP.
Dung dịch dán mảnh cắt bị nhiễm khuẩn: Sẽ ngộ nhận các vi khuẩn khác với HP, trường hợp này cần thay dung dịch dán mảnh cắt.
Thời gian nhuộm lâu hoặc nồng độ Giemsa cao đều làm cho mô bắt màu mạnh, chuyển màu xanh đen, khó nhận định kết quả, xử lý bằng cách làm nhạt màu qua cồn.
Nước dùng để rửa có nhiều cặn bẩn gây cặn bẩn trên tiêu bản, khó đánh giá kết quả, cần sử dụng nguồn nước sạch và sử dụng lõi lọc nếu cần.
Thuốc nhuộm cũng có thể bị cặn và nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến việc đánh giá kết quả, nên thay thuốc nhuộm mới.
Dung dịch Giemsa pha loãng chỉ pha trước khi nhuộm.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
Nhuộm Giemsa [/ˈɡiːmzə/] là tên một phương pháp nhuộm trong nghiên cứu sinh học tế bào, mang tên của nhà hoá học kiêm nghiên cứu vi khuẩn học người Đức là Gustav Giemsa đã sáng tạo ra, ban đầu để nghiên cứu về mô bệnh học ở người bệnh sốt rét và một số ký sinh trùng khác.[1][2][3] Phương pháp này phát triển và cải tiến từ kiểu nhuộm của Dmitri Leonidovich Romanowsky,[2] hiện nay đã được cải tiến ít nhiều và được dùng phổ biến trong nghiên cứu di truyền học tế bào, chủ yếu là nghiên cứu nhiễm sắc thể. Trong tiếng Anh, tên phương pháp này là Giemsa stain hay G stain [nhuộm G].
Chẳng hạn, trùng roi Trypanosoma Cruzi gây bệnh Chagas chắc chắn phải có mặt trong máu người bệnh, nên sau khi tiến hành nhuộm G mẫu máu của người bệnh, thì dễ dàng được phát hiện "thủ phạm" này dưới kính hiển vi.
Vùng nhiễm kí sinh trùng Myxobolus cerebralis gây bệnh Whirling đã nhuộm G.
- Một số thành phần trong thuốc nhuộm G kết dính với các cấu trúc đặc trưng trong một số loài kí sinh trùng, nên sau khi nhuộm có thể phát hiện ra sự khu trú của chúng trong mô người bệnh. Chẳng hạn, vùng nhiễm trùng Myxobolus cerebralis gây bệnh Whirling được phát hiện dưới kính hiển vi sau khi tiến hành nhuộm G [hình bên].
- Ở nhiễm sắc thể, các vùng dị nhiễm sắc chất [heterochromatin] thường có nhiều ađênin và timin [A-T] nên sau khi nhuộm G thì thường có màu tối. Ngược lại, vùng chất nhiễm sắc thật [euchromatin] lại thường nhiều guanin và xitôzin [G-X] nên khi kết hợp với thuốc nhuộm Giemsa thì xuất hiện dưới dạng băng sáng màu hơn dưới kính hiển vi.[4] Do đó, một số thành phần trong thuốc nhuộm G khi đã tự gắn vào các vùng nhiều A-T sẽ tạo ra các băng [dải, vệt] tối xen kẽ với các băng G-X sáng màu. Việc nhuộm màu đúng quy trình sẽ tạo nên hình ảnh chuẩn các NST có những băng đặc trưng, nhờ đó tạo nên mô hình chuẩn của kiểu nhân với mỗi nhiễm sắc thể có các băng được đánh số theo quy ước khoa học, giúp xác định rõ và mô tả chính xác vị trí của một lô-cut gen hoặc nhóm mô-cut.[5]
- Thuốc nhuộm G là một hỗn hợp dạng bột của xanh methylen, eosin và Azure B, khi dùng được pha chế thành dung dịch. Thành phần cơ bản của thuốc nhuộm G như sau:[2]
| Thành phần | Gm/L |
| Bột Giemsa | 7.6 |
| Glycerol | 500 ml |
| Methanol | 500 ml |
- Đặt mẫu vật cần thử lên lam [phiến kính hiển vi] đã được cố định bằng metanol tinh khiết trong 30 giây [ngâm mẫu hoặc nhỏ vài giọt metanol lên lam]. Ngâm trong dung dịch Giemsa 5% [chỉ pha trước đó từ 10 - 20 phút], sau đó rửa bằng nước sạch [nước máy] rồi để khô.
- Mô học
- Kính hiển vi
- Phương pháp nhuộm G: //bimetech.vn/phuong-phap-nhuom-giemsa.html
- Kỹ thuật nhuộm băng G [G banding].
- Nhuộm Romanowsky.
| Wikimedia Commons có thêm hình ảnh và phương tiện truyền tải về Nhuộm Giemsa. |
- ^ Giemsa G [1904 Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenblau-Eosin-Färbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nocht’schen Chromatinfärbung. Centralblatt für Bakteriologie I Abteilung 32, 307–313.
- ^ a b c “Giemsa Stain: Principle, Procedure and Results”.
- ^ Shapiro HM, Mandy F [tháng 9 năm 2007]. “Cytometry in malaria: moving beyond Giemsa”. Cytometry Part A. 71 [9]: 643–5. doi:10.1002/cyto.a.20453. PMID 17712779.
- ^ “Gene-rich and gene-poor chromosomal regions have different locations in the interphase nuclei of cold-blooded vertebrates”.
- ^ Nussbaum, Robert; McInnes, Roderick; Willard, Huntington [2015]. Thompson & Thompson, Genetics in Medicine . Canada: Elsevier Inc. tr. 58. ISBN 978-1-4377-0696-3.
Lấy từ “//vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Nhuộm_Giemsa&oldid=66851729”